雙鏈特異性 dna 酶 (dsDNase)

PCR是在研究和診斷中檢測(cè)DNA存在的靈敏方法。PCR中使用的聚合酶經(jīng)常被大腸桿菌  DNA 污染  。當(dāng)靶向少量細(xì)菌DNA時(shí)，污染的DNA可能會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低和假陽(yáng)性。其他污染源可能是dNTP，緩沖液成分和引物/探針，以及在處理過(guò)程中引入的DNA。細(xì)菌的檢測(cè)和分型可以通過(guò)使用針對(duì)保守區(qū)域（即16S或23S rDNA基因）的寬范圍引物進(jìn)行。該方法對(duì)細(xì)菌DNA污染非常敏感，在大多數(shù)預(yù)混液和聚合酶中都可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA的痕跡。當(dāng)使用qPCR檢測(cè)或定量少量細(xì)菌DNA時(shí)，會(huì)污染  大腸桿菌 DNA可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

雙鏈特異性 dna 酶 (dsDNase)

• 雙鏈 DNA 特異性核酸內(nèi)切酶

• 熱易滅活

• 引物無(wú)降解。

性質(zhì)

dsDNase 是一種內(nèi)切酶，可裂解 DNA 中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生具有 5’-磷酸和 3’-羥基末端的寡核苷酸。dsDNase 具有*的比活性，估計(jì)比牛 DNase I 高 30 倍，且不耐熱。dsDNase 對(duì)雙鏈 DNA (dsDNA) 有特別強(qiáng)的偏好性。在鎂僅作為二價(jià)陽(yáng)離子和使用寡核苷酸作為底物的情況下，對(duì) dsDNA 的活性比對(duì) ssDNA 的活性高 5000 倍。因此該酶可用于特異性降解 dsDNA，使 ssDNA 基本完整。

來(lái)源：在畢赤酵母中重組生產(chǎn)。

活性：dsDNase 在 20-40 ℃ 溫度范圍內(nèi)具有高活性。至少需要 2.5 mm Mg

活性和宜 pH 值為 7.5。

熱滅活：dsDNase 在 65 ℃ 孵育 15 min *滅活，不可逆滅活需要 1 mM DTT。

儲(chǔ)存：-20 °C 條件下的短有效期為 2 年。4 °C 條件下可儲(chǔ)存至少 6 個(gè)月。該酶還可耐受多次凍融循環(huán)。

純度：dsDNase 純化至表觀均一性。

比活度：470 000 Kunitz 單位/mg。

單位定義：一個(gè)單位定義為 260 nm 處吸光度增加  0.001/min，在 50 mM 醋酸鈉 pH 值中使用 50 mg/mL 高 MW DNA

5.0 和 5 mM MgCl2 (Kunitz,1950)。

“從 PCR 預(yù)混液中快速去除污染 DNA”

熱滅活

0 5 10 15 20 25 30

時(shí)間 (min)

圖 1：dsDNase 的殘留活性。將 200µl 試驗(yàn)緩沖液中的 60U dsDNase 在 65 ℃ 下孵育。在時(shí)間間隔取出等份試樣，并測(cè)定殘留活性。

dsDNase 特異性

使用標(biāo)記為 5'-的 FAM 和 3'-的 DarkQuencher® 的 15 聚寡核苷酸測(cè)定 dsDNase 對(duì)底物的特異性。熒光隨時(shí)間的增加速率與酶活性成正比。在表 1 中，我們看到了 dsDNase 對(duì)雙鏈和單鏈 DNA 和 RNA 寡核苷酸的相對(duì)活性。

dsDNase 對(duì)雙鏈 DNA 具有高度特異性，使其他核酸不受損害。

PCR 預(yù)混液去污

大多數(shù)可用的 Taq 聚合酶被細(xì)菌 DNA 污染。這是基于 PCR 的細(xì)菌分型和檢測(cè)中的一個(gè)問題，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。dsDNase 的*性質(zhì)使其非常適合在加入 DNA 模板之前從 PCR 預(yù)混液中去除污染的 DNA。在圖 2 中，我們用不同量的 dsDNase 處理了 PCR 主混合物，并使用廣譜細(xì)菌 DNA 特異性引物檢測(cè)主混合物中終污染的細(xì)菌 DNA。僅未處理的 PCR 主混合物

在非模板對(duì)照 qPCR 中給出陽(yáng)性信號(hào)。

圖 2：用 0、0.5、1 或 5U dsDNase 預(yù)孵育宜 PCR 緩沖液。所有 dsDNase 處理導(dǎo)致可擴(kuò)增 DNA 的*去除。藍(lán)線：未處理的反應(yīng)混合物。

工作流程-PCR 預(yù)混液的去污

向 PCR 預(yù)混液中加入 dsDNase

孵育并滅活 37 ℃，15 min-65 ℃，15 min

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