Real-time PCR實驗注意事項
實驗中的一些好習(xí)慣
加入試劑之前,把它混勻一下,以免放置時間長了濃度不均
移液槍用完之后要歸到zui大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性
一定要記著關(guān)水浴箱，切記切記
多和大家討論，同時多關(guān)注別人討論的經(jīng)驗，這幾乎是zui快提高的捷徑了
所有的試劑都自己配，出了問題才好找原因
防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。
6. 設(shè)置RNA操作實驗室，所有器械等應(yīng)為。
二、常用的RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能*抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
因為DEPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA，因此在分離和純化RNA過程中不能使用，而且它與一些緩沖液（例如Tri）不能相容
在所有RNA實驗中，zui關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
研究人員造成的污染 RNA酶zui主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進(jìn)行RNA實驗時應(yīng)勤換手套。
但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理
（一）動植物總RNA提取-Trizol法
Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA*蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly（A）+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。
2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。
3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。
4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。
5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會有蛋白質(zhì)污染，影響比值
2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
總mRNA的提取（自己的經(jīng)驗）
一、 關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑
1． Chloroform：氯仿 （分析純）
2． Isoproplyl alcohol：異丙醇（分析純）
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。
4． RNase-free water：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃過夜，并高壓滅菌即得（150℃ 3小時）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 關(guān)于Trizol Reagent的使用過程：
1． Homogenization（勻漿）
a. Tissues：組織
每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。
b. Cells Grown in monolayer（單層細(xì)胞接毒后出現(xiàn)病變的）
針對JEV細(xì)胞總RNA的抽提法：
BHK21細(xì)胞長成單層后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。出 現(xiàn)75%-100%的病變時，以PBS（預(yù)冷）沖洗細(xì)胞兩次，直接在細(xì)胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細(xì)胞（細(xì)胞瓶有兩 種常用規(guī)格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細(xì)胞瓶而定，以蓋滿瓶 底為度，而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，否則可導(dǎo)致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮）
（1） 組織接入預(yù)冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細(xì)胞，置室溫5min，以使核蛋白復(fù)合物*分離。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。
（3） 4℃離心，10000g×15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol試劑量的60%。
（4） 仔細(xì)吸取上層水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。
（6） 4℃離心，10000g×10min。RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。
（7） 棄上清液，加入預(yù)冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震蕩，充分洗滌沉淀，4℃離心，5500g×5min。棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?/span>
（8） 抽提出的細(xì)胞總RNA干燥后加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結(jié)果應(yīng)為：A260/280 ratio<1.6。
（9） 分離組織10mg（純組織）加800ul Trizol試劑。
（10） 擴增產(chǎn)物的鑒定：。
DEPC處理方法如下：
1. DEPC處理
（1）DEPC水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。
（2）Tip頭（槍頭）、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭；EP管和PCR反應(yīng)管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37℃浸泡過夜，高壓滅菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR儀來控制溫度和時間的，所以RT是在PCR反應(yīng)管中作的。
4. 操作過程中要戴一次性手套，并經(jīng)常換手套。
把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭后，加入1-2ml的0.1%DEPC水，在滅菌就行了；現(xiàn)在有進(jìn)口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的
如何消除污染
機器運行完后，取出PCR產(chǎn)物時不能隨便丟棄，應(yīng)該用塑料手套或其他打結(jié)包好后丟入垃圾桶。
（1） 試劑：mixer盡量分裝，不要原瓶多次取用。
（2）加樣：原則是DNAzui后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面，混合均勻之后再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。
另外，普通實驗室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關(guān)系，zui容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。
目 前，國內(nèi)外各個公司提供的診斷試劑盒大多采用了UNG來防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，來源于大腸桿菌重組克隆表達(dá)。
RNA定量
RNA也至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計比較 不同標(biāo)本之間就更不準(zhǔn)了。
RNA的貯藏，zui主要的是溫度，－20不夠，－80，液氮zui保險
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度 的影響
RT-PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現(xiàn)象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行
一定要做內(nèi)參的，每一次，我想。不作內(nèi)參的結(jié)果是不可信的
電泳可以不一起跑，沒有關(guān)系，計算的是相對表達(dá)程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達(dá) 量，不是表達(dá)量
mRNA的分離與純化中
步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly（A+）尾處的二級結(jié)構(gòu)，使Poly（A+）尾充分暴露，從而提高Poly（A+）RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié) 合，否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
下面，我們介紹一個可以確認(rèn)RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3）保溫試驗
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當(dāng)然，它們的條帶也要符合方法2中的條件）， 則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
PCR污染與對策
）PCR擴增產(chǎn)物污染.這是PCR反應(yīng)中zui主要zui常見的污染問題，所以，擴增區(qū)的儀器什么如槍頭等要注意。
還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.
1標(biāo)本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；
2. PCR擴增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴增；
3. 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。
各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。
切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。
使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的度
反應(yīng)液污染
可采用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA的序列；
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
1、提取mRNA時所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高壓滅菌，再烘干。
2、用DEPC水洗過后當(dāng)然不能用雙蒸水洗了。那你用DEPC處理還有什么意義呢？還要用雙蒸水洗嗎？
3、玻璃器皿干烤：180度，8小時或更長時間；小器皿也可以用少許氯仿處理一下。另外，鐵制品、研砵等也可倒上酒精直接燒。
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